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(1)可能为转染效率低a.优化转染实验条件,用较易转染的质粒做阳性对照(如转染过表达荧光蛋白质粒);b.确保转染DNA的质量,可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA质量进行鉴定;c.选择活性较高,处于指数分裂期的细胞进行转染。(2)可能为启动子活性低或诱导失败a.转染后的细胞培养使用特异性诱导启动子的条件;b.优化细胞的培养条件,提高萤光素酶的表达量;c.更换强启动子(如SV40、CMV)。注:海肾萤光素酶基因作为内对照,其表达应不受时期、部位、环境影响,因此常用组成型表达的TK启动子。(3)样品裂解效率低a.细胞培养时间不宜过长,12-36h内最好,长时间培养后,细胞可能会难裂解。b.加入的裂解液需足量,保证细胞能够充分裂解。(4)检测过程操作不规范a.选择合适的检测仪器,能够检测化学发光或者生物发光的仪器都适用于该实验;b.需加入足量底物,保证底物的饱和,否则会造成检测结果出现很大偏差;c.室温反应。反应时各个组分(细胞裂解产物,底物工作液等)都需要调整到室温;d.萤光素酶的半衰期一般约30min,加完底物后可立即检测,尽量在30min内完成。(5)底物氧化失效a.底物避光密封保存,萤火虫萤光素酶底物-20℃保存;海肾萤光素酶底物推荐-80℃保存;b.反应工作液建议现用现配。◆进行检测的过程中,萤光信号值太高该如何进行调整?(1) 减少质粒转染量。(2)细胞样品裂解后,离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测。注:不建议通过减少底物量来降低荧光值,需要保证底物的饱和来反映萤光素酶真实的表达水平,否则会造成检测结果出现大的偏差。
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